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我們研究了5年WB實驗,告訴你遇到問題怎么辦!

實驗原理


Western Blot 法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測物是蛋白質,「探針」是抗體,「顯色」用標記的二抗。經過 PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質樣品,轉移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質,且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。


以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原,與對應的抗體起免疫反應,再與酶或同位素標記的第二抗體起反應,經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。


1、western blot 的優點


答: 靈敏,可達ng級,用Ecl顯色法理論上可達pg 級。方便,特異性高。


2、為什么我的細胞提取液中沒有目標蛋白?


答: 原因有很多:


a) 你的細胞中不表達這種蛋白質,換一種細胞;


b) 你的細胞中的蛋白質被降解掉了,你必需加入PMSF,抑制蛋白酶活性;


c) 你的抗體不能識別目標蛋白,多看看說明,看是否有問題。


3、我的細胞提取液有的有沉淀,有的很清亮,為什么呢?


答: a) 有沉淀可能因為你的蛋白沒有變性完全,可以適當提高SDS 濃度,同時將樣品煮沸時間延長, b) 也不排除你的抗原濃度過高,這時再加入適量上樣緩沖液即可。


4、我做的蛋白質分子量很小(10KD),請問怎么做WB?


答:可以選擇0.2μml的膜,同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起,再轉移。其他按步驟即可。


5、我的目的帶很弱,怎么加強?


答:可以加大抗原上樣量。這是最主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。


6、膠片背景很臟,有什么解決方法?


答:減少抗原上樣量,降低一抗濃度,改變一抗孵育時間,提高牛奶濃度。


7、目標帶是空白,周圍有背景,是為什么?


答:你的一抗濃度較高,二抗上HRP 催化活力太強,同時你的顯色底物處于一個臨界點,反應時間不長,將周圍底物催化完,形成了空白即“反亮現象”。將一抗和二抗濃度降低,或更換新底物。


8、我的膠片是一片空白,是怎么回事?


答:如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現在一抗和抗原制備上。


a) 二抗的HRP 活性太強,將底物消耗光;


b) ECM底物中H2O2,不穩定,失活;


c) ECL底物沒覆蓋到相應位置;


d) 二抗失活。


9、我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢?


答:a) 可能是紅燈造成的, 膠片本來就被曝光了,可以在完全黑暗的情況下操作.看是否有改善.;b) 顯影時間過長。


10、DAB好還是ECM好?


答:DAB 有毒,但是比較靈敏,是HRP 最敏感的底物;ECM結果容易控制,但被催化時靈敏度差一點,但如果達到閥值,就特別靈敏,可以檢測pg 級抗原。要看你實驗的情況。


11、抗原檢測出的分子量比資料上的大,是怎么回事?


答:a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量,煮沸變性時間延長,可以打開二聚體。b)蛋白本身的修飾如:糖基化,磷酸化等。


12、蛋白轉移不到膜上,但膠上有,同時Marker 轉上去了,為什么?


答:可能是:a)樣品濃度過低;b)轉移時間不夠。


13、磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等?


答:NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑,一般最好加。但是不加也可以,大部分時候是不用加的。


14、要驗證某個細胞上有無該蛋白的存在,需要做免疫組化和western blot試驗嗎?做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎?


答:① 免疫組化可以用來進行定位,但是不能精確定量,而且有時會有假陽性,不易與背景區分;Western blot可以特異性檢測某個蛋白質分子,進行定量,但是不能定位。


② 兩種實驗的一抗有時候不能通用,公司的產品說明一般都會說明可以進行什么實驗,在免疫組化時,是否適合石蠟切片或者冰凍切片。


15、做Western Blot時,提取蛋白后凍存(未加蛋白酶抑制劑),用的博士德的一抗,開始還有點痕跡,現在越來越差,上樣量已加到120μg,換了個santa cloz的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎?


答:懷疑是樣品問題,可能是:


樣品不能反復凍融;


② 樣品未加蛋白酶抑制劑。同時,建議檢查Western Blot過程, 提高一抗濃度。對于加蛋白酶抑制劑來說,一般加PMSF就可以了,最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。


16、細胞水平要做western blot,多少細胞提的蛋白夠做western blot?


答:一般5×10^6就足夠了。


17、同一樣品能同時提RNA又提蛋白么?這樣對western blot有無影響?


答:能,沒有問題。


18、同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎?


答:當然可以,有的甚至可以同時測幾十種樣品。


19、如果目標蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白,操作需要注意什么?


答:如果是膜蛋白和胞漿蛋白,所用的去垢劑要溫和得多,這時最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。


20、我的樣品的蛋白含量很低,每微升不到1微克,但是在轉膜時經常會發現只有一部分蛋白轉到了膜上,就是在轉膜后染膠發現有的孔所有的蛋白條帶都在,只是顏色變淡了,有什么辦法可以解決?


答:你可以加大上樣量,沒有問題,還有轉移時你可以用減少電流延長時間,加20%甲醇。


21、想分離的蛋白是分子量200kd的,SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適?積層膠的濃度又該用多少?這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎?


答:200kd的蛋白不好做, 分離膠用7%,積層膠 3.5%。


22、如果上樣量超載,要用什么方法來增加上樣量?


答:可以濃縮樣品,也可以根據你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超載30%是不會有問題的。如果已經超了不少了,而且小分子量的也要,可以考慮加大膠的厚度,可以試試1.5mm的。


23、蛋白變性后可以存放多久?


答:-80℃,一兩年沒有問題。最關鍵兩條:不要被蛋白酶水解掉;不要被細菌消化掉(也是被酶水解了)。


24、我所測定的蛋白分子量是105KD,按理說分離膠應當采用7.5%,但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11%的配方,不知為何?


答:上述提到的兩種凝膠均可以使用,因為105KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內,但需注意條帶位置。


25、二抗是生物素化的抗體,三抗是親和素生物素體系,不知采用這樣的方案后,封閉液是否要作調整,能否再用5%的脫脂奶粉呢?好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的生成,是嗎?


答:不能使用脫脂奶粉,因為脫脂奶粉中含生物素,用BSA代替應該好一點。


26、問一般一次上樣的蛋白總量是多少,跟目的蛋白的表達量有關系嗎?


答:Western Blot一般上樣30-100微克不等,結果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和孵育時間都有關系,也與顯色時間長短有關。開始摸條件時,為了拿到陽性結果,各個步驟都可以量多一點時間長一點,當然背景也就出來了。要拿到好的結果,如果抗體好的話比較容易,抗體不好的話就需要反復地試了,當然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。


27、做組織樣品的western的時候,怎樣處理樣品?


答:必須進行研磨、勻漿、超聲處理,蛋白質溶解度會更好,離心要充分,膜蛋白需用更劇 烈的方法抽提,低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強,需要注意抑制蛋白酶的活性(加入PMSF)。


28、問大分子量蛋白200KD,在做western要注意什么呢?


答:做200kd蛋白的Western Blot時要注意,分離膠最好選擇>7%的;剝膠時要小心;轉移時間需要相應延長;要做分子量參照(否則出現雜帶不知道如何分析)。


29、有什么方法可以提高上樣量?


答:a)可以濃縮樣品;增大上樣體積來增大上樣量;


b)用5倍的上樣緩沖液來稀釋變性.


30、蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求?


答:上樣量要根據實驗的要求來定, 如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等,如果只是要定性,則沒有太大的關系, 盡量多上就行了, 但是不要超載。

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