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五分鐘速成!WB步步驚心之抗體那些事兒



中洪實拍孵育抗體圖


抗體孵育流程


1、把封閉好的膜放在密閉塑料袋或者培養皿中,加入一抗溶液孵育。搖床上緩慢搖動,4℃過夜。


2、用洗膜緩沖液漂洗PVDF膜2次,每次7min。把膜放在密閉塑料袋或者培養皿中,加入二抗溶液孵育。搖床上緩慢搖動,室溫1h。


3、用洗膜緩沖液漂洗PVDF膜3次,每次7min。


抗體哪家強?


WB實驗里面最為昂貴的產品可能就是抗體了,知名的抗體品牌很多,Abcam,CST,Millipore,BD,Santa,R&D等都是實驗中常用的國外品牌,國內品牌Boster還可以,但是在WB領域建議首選CST,因為CST性價比相對較高,且使用濃度一般按推薦的就可以了,抗體效價高。


當然由于CST抗體產品種類遠遠不能滿足每一位研究者的需要,那么就需要大家在其他如Abcam、Millipore等品牌中選擇需要的抗體,這里建議大家的是選擇抗體的時候,最好看看說明書里面是否有可供參考的驗證圖片或者有文獻使用了該抗體發表的圖片,因為圖片可以在很大程度上看出抗體的特異性如何。


內參抗體的選擇


內參即是內部參照(Internal Control),對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins),它們在各組織和細胞中的表達相對恒定,在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物,以校正蛋白質定量、上樣過程中存在的實驗誤差,保證實驗結果的準確性。詳細可參考下放內參選擇表:


抗體“疑難雜癥”


1. 一抗,二抗的比例是否重要?


解答:比較重要,調整好一抗,二抗的比例,可以去掉部分非特異的本底。


2. 做細胞信號傳導,要做磷酸化某因子Western Blot,其二抗有何要求?


解答:對二抗無要求,要看你實驗條件來選擇,一般推薦用HRP標記的二抗。


3. 同一公司的另外抗體用這個稀釋度做出來效果很好,所以沒做預試,怕費時間,用什么樣的稀釋度比較好呢?我用的ECL+plus試劑盒顯色。轉膜過夜,一抗孵育也是過夜的,若封閉也過夜的話就要四天才看的到結果了。


解答:不同抗體,即使是同一公司的抗體,其最佳的抗體稀釋度也是不一樣的,需要你實驗摸索。我覺得轉膜過夜好像沒有必要吧,轉膜的目的也就是將蛋白轉到膜上就行啦,何必浪費時間呢。至于具體的轉膜時間,還要看你的目的蛋白分子量的大小;轉膜的設備,是半干式,還是濕式。一抗當然可以過夜,如果你想所短Western Blot時間的話,可以增高一抗的孵育溫度,我們實驗室一般37度,兩小時就足夠了;你可以參照抗體說明書。至于一抗和二抗得稀釋度,你可以一抗1:1500;二抗1:20000試試。另外建議你洗膜時,多洗幾次,最好是在封閉;一抗和二抗后至少是5x5min,跑一張好膜不容易,多盡點心吧,這樣不會浪費你的時間,只會節省你的時間!


4. 免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎?


解答:免疫組化時抗體識別的是未經變性處理的抗原決定簇(又稱表位),有些表位是線性的,而有的屬于構象型;線性表位不受蛋白變性的影響,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;構象型表位由于受蛋白空間結構限制,煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個氨基酸,也就是線性表位,那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western,而如果抗體識別構象形表位,則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區間。(限于單抗)


5. Western Blot 中抗體的重復應用問題。


解答:抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用,但是如抗體比較珍貴,可反復使用2-3次。稀釋后應在2-3天內使用,4度保存,避免反復凍融。

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