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手把手教你近端腎小管上皮細胞原代分離

實驗操作流程:


       1、取雙腎,置于冷的PBS中;


       2、去除腎蒂和包膜,在體式顯微鏡下切除腎皮質;


       3、將腎皮質剪碎,移入EP管中,PBS洗3次;


       4、清洗完畢,沉淀用1g/LⅠ型膠原酶,37℃,30min消化;


       5、加入3倍體積的完全培養基終止消化;


       6、將細胞懸液過80目篩;


       7、收集懸液,200目篩、1000rpm.離心5min;


       8、沉淀用45%percoll分離液制備25ml懸液;


       9、懸液置于5ml 100%percoll上,14000rpm,4℃,離心25min.;


       10、分層,選擇倒數第二層細胞懸液;



       11、得到近端腎小管上皮細胞,用DF12+10%FBS+雙抗鋪板


注意事項:


       鼠齡要選小一些的,我們一般選2周內的,這樣細胞生長活性更好



Q:為什么我取得原代腫瘤組織,分離的卻不是腫瘤細胞?


A:取材時,我們要熟悉所需組織的類型和部位特征,選擇腫瘤細胞集中、活力較好的部分。避免結締等正常組織。


Q:若是細胞中混成纖維細胞,如何去除?


A:成纖維細胞的去除對于腫瘤細胞培養十分重要。由于成纖維細胞貼壁速度較腫瘤細胞快,可利用反復貼壁法使二者分離,進而達到清除成纖維細胞的目的。


Q:為什么離心后,沒有細胞分離出來?


A:需要考慮消化酶的因素,由于腫瘤組織較致密,胰酶無法消化,一般選用膠原酶,如膠原酶Ⅳ。若是組織十分致密可以再結合機械法,如研磨或者攪拌加速細胞分散。如下表為二者的區別:



注:膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細胞專用膠原酶,根據分離的組織類型需選擇合適的膠原酶類型。



Q:消化時間如何確定?


A:具體的消化酶的量和消化時間可根據組織類型和多少進行調整。


Q:消化之前為什么用EDTA?


A:EDTA是一種非酶消化物,又稱螯合劑,對一些組織,尤其是上皮組織分散效果好。與細胞上的鈣、鎂離子結合形成螯合物后,形成的機械力可使細胞分散。




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