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shRNA表達克隆的應用

     基因表達下調 shRNA克隆對單個基因的基因表達抑制效應可以通過和一個包含不規則序列的陰性對照克隆來比較研究。


     信號通路研究 我公司的人類基因ORF克隆按照不同的信號傳導、代謝、疾病通路和相關性、基因家族等進行了分類。將已知同一通路的shRNA克隆以96孔或384孔板的形式排列在一起,可一次研究一組基因在某一信號通路中的功能。目前我公司已可提供針對人類全部激酶基因的shRNA克隆,并已按照按不同激酶的功能進行了分類。


     ORF表達克隆確證 我公司已有shRNA相應人類靶基因的ORF克隆,可裝在各種表達載體中,帶有不同的標簽和跟蹤標記基因。這些正常的ORF表達克隆和在shRNA靶序列帶有沉默突變的同樣的ORF表達克隆,可以用于shRNA確認研究和基因功能拯救研究。


     OmicsLink? shRNA表達克隆的基因表達抑制效應的檢測方法
     1.q-RT-PCR檢測 shRNA的表達,能導致目的基因所轉錄的mRNA被切割和降解,從而降低蛋白的表達,所以推薦檢測表達抑制效應的第一步是做q-RT-PCR。我公司提供確證過的對應目的基因的q-RT-PCR引物。


     2.Western blot檢測 檢測表達抑制效應,大部分都需要用Western Blot方法來檢測所表達蛋白表達水平的下調。我公司提供2500多種單克隆抗體和針對人類蛋白的多克隆抗體。


     3.功能檢測 檢測表達抑制效應,還可通過生物和生化的終點分析方法,分析細胞增殖、克隆形成、細胞周期、細胞遷移等,根據目的基因具體的功能而定。


     4.跟蹤標記基因或蛋白進行功能檢測 當所研究基因的內源轉錄水平很低,并且/或者q-RT-PCR和WB檢測不適宜的時候, 表達抑制效應也可通過共轉導shRNA克隆和一個含目的基因并帶了跟蹤標記基因的表達克隆,跟蹤標記基因所編碼的報告蛋白可用于功能檢測。靶基因的mRNA遭shRNA的破壞,就同時導致了跟蹤標記基因的mRNA遭破壞,從而表現為報告蛋白的表達下降。這樣,表達抑制效應就可以用報告蛋白的酶活性分析結果來進行量化。

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