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檢測細胞存活與增殖?MTT還是MTS?

由于MTT經還原所產生的甲瓚產物不溶于水,需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加,也會對實驗結果的準確性產生影響,而且溶解甲瓚的有機溶劑對實驗者也有損害。關于MTT法,上次中洪君也有推送過:實驗專欄丨這5年做MTT實驗的總結都在這兒了。





MTT法流程圖


為此,Oween等設計出了一種新型的MTT類似物一MTS,MTS法原理同MTT法,但優于MTT法。MTS在PMs(Phenazinemethosulfate)的存在下可被活細胞還原形成水溶性的甲增產物(故MTS需與PMS合用),因而被用來建立了可檢測細胞活力和增殖能力的MTS檢測法。 MTS形成的水溶性甲臘產物在490~500nm處有最佳吸收,我們一般選擇492nm。每孔檢測的細胞數量在3000~5000為宜,作用一小時后即可檢測,以3小時的檢測結果為最佳。


與MTT法相比,MTS有以下優點


? 1、操作簡便,MTS中生成的甲脂極具水溶性,省去了MTT法需離心除去上清液和加入有機溶劑這一步驟,可一次檢測大量樣品。 


? 2、MTS易于配制和儲存,在PH>6.5的緩沖溶液中易溶解配成溶液,且可在4 ℃下保存一段時間。 


? 3、快速,加入藥后一小時即可檢測結果(2-3小時為最佳),而MTT法的作用4個小時。 


? 4、敏感,比MTT法測定統一樣品敏感性高。 


? 5、特異性強,MTT法形成的甲增產物為桔黃色,培養體系中一些黃色代謝產物和試劑均可影響檢測結果,而MTS/PMS法形成的甲增產物為深棕色檢測時外部因素影響較小,所以特異性較強。 


? 6、重復性良好。


MTS法的原理:




還原為黃色的Fo圖為MTS被乳酸脫氫酶rmazan


MTS檢測細胞增殖protocol:


1)收集對數期細胞,調整細胞懸液濃度,每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度3000~5000/孔,5%CO2,37℃孵育。 


2)24小時后吸去培養基,每孔加入100ulMTS溶液,即MTS母液與培養基比例為1:9,繼續培養1-3h。在酶標儀OD492nm處測量各孔的吸光值。 


3)連續檢測3天,每天3復孔,在酶標儀OD490nm處測量各孔的吸光值。 


4)記錄3天的各孔吸光值,使用GraphPad prism軟件計算細胞增殖曲線。


MTS操作注意事項:


1、MTS需避光,所以操作時應注意避光。 


2、培養過程中換液,如果培養時間較長,應適當更換細胞培養液,補充營養物質。


3、防止邊緣效應,96孔板邊緣應該滴加PBS,邊緣孔的水分揮發較快,藥物易被濃縮,對實驗影響大。邊緣孔加入PBS 溶液后能夠在一定程度上保持實驗組的水分。


中洪實驗室細胞增殖檢測法推薦


1、細胞類型,如果是懸浮細胞,MTT方法則不適用,MTT需要吸取上清后再加入DMSO溶解甲臜,而懸浮細胞不貼壁,容易造成結果不準確 。


2、細胞數,如果細胞數少于500,則推薦使用基于ATP的檢測方法,該方法較為靈敏,能夠檢測很少的細胞數。


3、檢測時間,如果實驗時間不允許,需要短時間出穩定準確的實驗結果,推薦采用基于其他氧化還原酶的檢測和基于ATP的檢測方法。


4、藥物處理。如有藥物處理,且藥物具有氧化性,則不推薦MTT, 氧化性的藥物會和MTT發生氧化還原反應而影響MTT法的試驗結果。另外如果藥物帶有顏色,推薦采用基于ATP的檢測方法。


5、高通量篩選。推薦采用MTS,CCK-8這兩種方法,操作較為簡單,且價格便宜。但如果是藥物的高通量篩選,且藥物處理時間較短,帶有顏色,推薦采用基于ATP的檢測方法。


——————中洪博元其他部分實驗展示——————





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