新浪微博
微信互動

手把手教你流式凋亡染色!

Annexin V & 7 氨基放線菌素(7-amino-actinomycin D, 7-AAD)或碘化丙啶(Propidium iodide, PI)雙染法檢測細胞凋亡原理。


正常細胞(活細胞)具有完好的細胞膜,此時細胞膜的組分之一——磷脂酰絲氨酸(phosphotidylserine,PS)位于細胞膜的內側,當細胞發生凋亡時,細胞膜的結構發生改變,這使得原本在細胞膜內側的PS外翻到細胞膜的表面,這種現象在凋亡的早期就會出現,因此就可以用與PS具有高親和力、標記了熒光素的膜連蛋白V(Annexin V)來檢測早期凋亡的細胞。


由于晚期凋亡和一些壞死的細胞也可以與Annexin V結合,因此需要引入另一種指標來將早期凋亡的細胞與之區分,這種指標就是細胞膜的通透性。與正常細胞和早期凋亡細胞不同,晚期凋亡及壞死細胞的膜通透性會增加,因此,一些原本不能進入到正常細胞內的核酸染料(如7-AAD和PI)便有機會進入細胞內與DNA結合。


所以,通過Annexin V和7-AAD /PI雙染的方法,就可以把早期凋亡的細胞與晚期凋亡加壞死的細胞區分開來。


Annexin V和7-AAD雙標測凋亡流式染色實例


小鼠腹腔巨噬細胞(每樣2-5×105個細胞)Annexin V和7-AAD雙染實例(本實例中巨噬細胞凋亡是通過紫外線30分鐘照射誘導的)


1. 標志物:


活細胞:Annexin V-7-AAD-;早期凋亡細胞:Annexin V+7-AAD-;晚期凋亡和壞死細胞:Annexin V+7-AAD+;某種特定壞死細胞:Annexin V-7-AAD+;


2. 流式細胞儀:BD FACSCalibur;


3. 流式抗體及用量:1×Binding Buffer(250ul/test,聯科生物的5×Binding Buffer用ddH2O配制,貨號:LK-AP101-100-BB);Annexin V-APC(1ul/test,貨號:BMS306APC,eBioscience);7-AAD(5ul/test; 貨號:559925,BD);


4. 染色條件:本實例用胰酶將細胞消化下來進行染色,并沒有染細胞的表面分子,如需標記表面分子,切記勿用胰酶,請在染Annexin V和7-AAD之前先按常規染法標記表面分子,洗去多余抗體后即可用1×Binding Buffer重懸細胞,加入Annexin V和7-AAD,室溫避光孵育15分鐘即可。由于此法中細胞未固定,因此需在染色后盡快檢測;


5. 分析軟件:Cell Quest;


6. 圈門策略及染色:FSC/SSC圈門策略請視不同細胞而定;


7. 常見問題小貼士:

A. 由于細胞凋亡因細胞種類、細胞所在體內環境、體外給予的刺激、染色過程中的操作不同而迥異,因此Annexin V和7-AAD雙染檢測凋亡,需要按照各自具體情況進行多次實驗,以掌握自己實驗條件下細胞凋亡的套路。


B. Annexin V染色的常見特性如上圖所示,即使未凋亡的細胞(Annexin V-7-AAD-細胞),經過染色后在流式圖上的位置也會右移,小白曾經和多位做過凋亡的伙伴們交流過,這種現象是Annexin V染色特有的,請大家不要奇怪。小白曾經試圖通過洗去多余抗體來將活細胞群(Annexin V-7-AAD-細胞群)調整到我們通常認為的“陰性細胞”位置,但是從實例圖中大家也能發現這種方法是行不通的。至于為什么洗去多余抗體不能解決“移位”問題,請恕小編才疏學淺,至今還不知道原因,只是建議大家不要采用洗多余抗體的方法來調整細胞在圖上出現的位置,相信大家也發現了洗過之后,各群細胞比例已經發生改變了。


C. 由于平時實驗中的細胞來之不易,久而久之便養成了節約的好習慣,所以本實例中采用的細胞數量較少,如果小伙伴們采用的細胞數量可以土豪到106級別,可采用300ul-500ul體系,加2ul-5ul Annexin V和10ul 7-AAD,具體染色條件請自行采取滴度實驗。


D. 使用Annexin V和PI試劑盒的童鞋染色也可按照試劑盒說明來操作。


E. 此法的上機檢測過程沒有特別之處,與一般分子的上機檢測類同,小伙伴們無需多慮。只是提醒一下使用PI的小伙伴們,PI的發射譜很寬,可以用第二或第三通道來檢測,大家任選其一即可。另外,小伙伴們要特別注意在FSC/SSC圈門時,所選細胞范圍會對結果造成較大影響,大家自己分析的時候就會發現這一點,所以小伙伴們在分析的時候要把所有分析對象都圈進FSC/SSC的門內,這樣才能反映真實情況。


F. 本法的優點在于無需固定細胞、染色快速,但是缺點是當細胞膜破裂時Annexin V也可與細胞結合,而且在一些自噬受損的細胞中,PS外翻可能受阻,所以此時Annexin V就不再適合用于早期凋亡檢測了。

上一篇:檢測細胞存活與增殖?MTT還是MTS?
下一篇:
分享到:
足球狂欢节免费试玩